DRIP-seq

  • 簡介
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  • 實驗流程
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  • 背景介紹

    R -loop是由轉錄的RNA鏈與打開的雙鏈DNA其中一條鏈發生堿基互補配對,形成RNA-DNA雜合鏈,同時與未配對的另一條DNA鏈遊離在外組成的三方結構 [1]。它們分布廣泛,占哺乳動物基因組的 5% [2,3]。 R-loop經常出現在基因組的啟動子CGI和轉錄終止位點,形成R-loop的結構因素包括高度的GC偏倚(GC skew,在TSS下遊的非模板鏈上,G比C富集)、G四聯體、DNA缺口和DNA/RNA修飾等[4]。它們在調節基因表達、DNA 複製以及 DNA 和組蛋白修飾方麵發揮著重要作用,具有重要的生物學功能。

    1: R-loop的結構[5]


    DRIP-seq與Arraystar LncRNA芯片、MeDIP-seq或者CHIP-seq聯合分析,可為揭示R-loop在表觀遺傳以及轉錄調控中的重要功能提供有價值的研究視角。


    R-loop通過影響DNA甲基化調控mRNA轉錄

    有研究發現,在運動神經元疾病肌萎縮側索硬化(ALS4)病人中,senataxin突變導致BAMBI(TGFβ的負調控因子)啟動子R-loop含量降低,進而促進啟動子DNA甲基化來抑製BAMBI轉錄,最終激活TGFβ信號通路,促進疾病發生發展[6]。


    圖2: ALS4病人senataxin突變抑製R-loop形成進而抑製BAMBI轉錄



    Antisense LncRNAs形成R-loop影響mRNA轉錄

    TCF21是與一種抑癌基因,在多種癌症中表達下調,它具有頭對頭反義lncRNA TARID(TCF21 antisense RNA inducing demethylation)。TARID在TCF21啟動子附近形成R-loop,被R-loop識別蛋白GADD45a結合,招募去甲基化酶TET1,促進DNA去甲基化來增強TCF21轉錄,影響細胞周期[7]。


    圖3: Antisense lncRNA通過形成R-loop調控TCF21啟動子DNA去甲基化及轉錄[4]



    R-loop高通量篩選平台DRIP-seq

    對於R-loop的篩選通常采用DRIP-seq(DNA:RNA hybrid immunoprecipitation and sequencing),該項目側重於通過NGS在基因組水平上檢測R-loops結構的分布。並且通過生物信息學分析,可以在不同的領域從中挖掘出更多有用的信息。

    DRIP-seq選擇 S9.6 抗體來富集 R-loop,S9.6 抗體用於特異性免疫沉澱 DNA:片段化後的 RNA 雜交體。然後可以通過對 R-loop的 DNA 鏈進行測序來實現 R-loop分析。


    參考文獻:

    [1] S. Hamperl, K.A. Cimprich, The contribution of co-transcriptional RNA:DNA hybrid structures to DNA damage and genome instability, DNA Repair 19 (2014) 84–94.

    [2] L.A. Sanz, et al., Prevalent, dynamic, and conserved R-Loop structures associate with specific epigenomic signatures in mammals, Mol. Cell 63 (1) (2016) 167–178.

    [3] Li. Miaomiao, et al., Modifications and interactions at the R-loop, DNA Repair 96 (2020) 102958.

    [4] Christof Niehrs and Brian Luke, Regulatory R-loops as facilitators of gene expression and genome stability.Nat Rev Mol Cell Biol. 2020 Mar;21(3):167-178.

    [5] A.H. Youssef, et al., The balancing act of R-loop biology: The good, the bad, and the ugly, J. Biol. Chem. (2020) 295(4) 905–913.

    [6] Christopher Grunseich et al. Senataxin Mutation Reveals How R-Loops Promote Transcription by Blocking DNA Methylation at Gene Promoters Mol Cell. 2018 Feb 1;69(3):426-437.e7.

    [7] Khelifa Arab et al., GADD45A binds R-loops and recruits TET1 to CpG island promoters. Nat Genet. 2019 Feb;51(2):217-223.

  • 嚴格的質控體係:設置陰性對照組和陽參,以控製文庫質量。

    穩定性高:實驗操作穩定性高,減少實驗操作帶來的誤差。

    靈活度高:能夠直接對有基因組信息的物種進行R-loop測序。

    提供數據可視化,豐富的注釋信息與文章發表級別的圖譜



  • 1.  基因組DNA抽提

    2.  超聲片段化DNA

    3.  S9.6抗體免疫共沉澱

    4.  R-loop洗脫與cDNA第二鏈合成

    5.  DRIP-seq文庫構建

    6.  高通量測序

    7.  數據分析

    8.  提供實驗報告


  • 1.R-loop peak注釋表


    2. R-loop peak 在不同基因特征上的分布。

    圖:餅圖顯示了R-loop peak在每個基因特征上的數目和比例。


    3. R-loop peak 在不同基因特征上的富集度


    圖:R-loop peak在不同基因組特征上的數目富集度和長度富集度。紅色柱子:peaks占總peaks數目的占比, 表示實際某基因特征的peak占比;藍色柱子:基因組特征區長度占所有基因特征區長度總和的占比,這個柱子可以等同於隨機分配情況下某基因特征內的peak占比。


     4.R-loop peakGenebody上的分布


    圖:R-loop peakGenebody周圍的分布。X軸表示到TSSTES的距離,Y軸表示peak區的數目。