環狀RNA絕對定量RT-PCR

  • 簡介
  • 服務流程
  • circRNA是目前生命科學領域新興的研究熱點分子之一。區別於傳統的線性RNA,circRNA具有獨特的閉合環狀結構,使得其對核酸酶不敏感,所以比線性RNA更為穩定,非常適合作為臨床診斷標誌物(biomarker)。近期研究表明,circRNA主要通過吸附miRNA抑製後者對相應靶基因的調控,稱之為競爭性內源RNA(ceRNA),而與疾病相關聯miRNA的相互作用說明circRNA對疾病的調控起著非常重要的功能。實時熒光定量PCR技術是在普通PCR反應體係中加入熒光試劑,利用熒光信號實時檢測PCR進程,避免了傳統PCR以終產物檢測定量產生的偏差,提高實驗的重複性。絕對定量的實時熒光定量PCR是在實時熒光定量PCR時加入標準品通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法,能夠專一、靈敏、快速、高重複性地精確定量起始模板濃度。


    2022世界杯竞猜app下载生物丨數譜生物為您提供環狀RNA絕對定量實時定量PCR技術服務,您隻需要提供保存完好的組織或細胞標本,本公司專業的技術服務人員就可替您完成絕對定量的實時定量PCR實驗操作和數據分析,提供給您完整的實驗報告。

    每微克 total RNA target 1 RNA拷貝數=X/3

    如果細胞的數量為106,總RNA為15ug,則每個細胞的target 1的拷貝數為:[X×15/3]/ 106

  • 1. 引物設計、合成

    設計並合成目的基因的特異性PCR引物。

    2. 樣品RNA抽提

    a. 若實驗對象為組織樣品,取適量(50-100mg)新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品,加1ml的RNA抽提試劑Trizol(Invitrogen),勻漿後抽提RNA。

    b. 若實驗對象為細胞樣品,每份樣品取1×106~1×107細胞,完全吸去培養液後加1ml的RNA抽提試劑Trizol(Invitrogen),裂解後抽提RNA。

    3. RNA質量檢測

    a.紫外吸收測定法測定RNA在波長260nm和280nm的吸收值,獲得RNA的濃度並通過A260/280及A260/230的吸收比值判斷RNA的純度。

    b.甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA純度和完整性。

    注:用於實時定量PCR檢測的RNA樣品,必須高純度、完整,沒有RNase 汙染(降解的樣品不能用於實時定量PCR檢測),同時提取方法必須保證所得樣品包含完整的小RNA部分。

    4. 逆轉錄合成cDNA

    每個樣品我們加入已知濃度的RNA(RNA Spike-in)並使用rtStar™ First-Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# AS-FS-001, Arraystar) 試劑盒進行反轉錄,合成cDNA第一鏈。

    5. 實時定量PCR

    在合成cDNA第一鏈中加入標準品與cDNA一同作為模板進行實時定量PCR擴增,,根據Ct值製備標準曲線。

    6. 分析結果、提供實驗報告

    各樣品的目的基因和標準品分別進行Realtime PCR反應。根據標準品繪製標準曲線,各樣品目的基因和RNA Spike in的cDNA拷貝數結果直接由機器生成。(每個樣品的目的基因cDNA拷貝數x RNA Spike in的RNA拷貝數)除以RNA Spike in的cDNA拷貝數,即為此樣品此基因的校正後的RNA拷貝數。